微生物测序样本准备方法总结
微生物测序样本准备方法
原文转自 诺禾致源，链接详见文末。本人有修改，并添加自己的经验。
在微生物测序中，样本的准备从根本上是确保获得高质量DNA的前提，而样本准备也正是让众多微生物科研工作者感到困扰的重要一步。今天就给大家分类介绍一下常见的微生物样本类型及采样方法。
医口样本类型
| 样本 | 种类 | 推荐生物学重复 |
|---|---|---|
| 肠道 | 粪便,粘膜 | > 6, 推荐 10 |
| 液体 | 尿,血液,脑髓液,唾液,痰,肺泡灌洗液,羊水 | 同上 |
| 拭子 | 口腔,生殖道,皮肤 | 同上 |
| 其它 | 组织,肝脏,眼部,胎盘等 | 同上 |
农口样本类型
| 样本 | 种类 | 推荐生物学重复 |
|---|---|---|
| 土壤 | 普通土,根际土,稻田土,污泥,沙土 | > 3(多点取样), 推荐5 |
| 水体 | 水库,河流,污水,海水,中水,油田,尾矿池,牛奶 | 同上 |
| 肠道 | 动物粪便,肠道 | >6, 推荐>10 |
| 其它 | 根内生菌,瘤胃,发酵液,单菌,病毒 | 同上 |
医口常见样本采集方法
粪便样本采集
1）准备好便盆和粪便容器，洗手，带上手套收集新鲜的粪便样本；
2）在实验室将装好受试者粪便样本，立即放在冰上进行分装并标记；
3）用无菌牙签或粪便取样器截取样品中段里部（粪便表层含有肠粘膜脱落细胞），外部容易污染，且接触空气后，部分细菌 DNA 开始降解；
4）用灭菌离心管每管称取0.5-10g左右粪便样本，每个样本取多管备份；
5）分装好后，若当天提取DNA，可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。
注：如粪便样品量较多或不能马上收集，最迟要在2小时之内全部收集完。肠道内容物样品采集
1）在实验对象死亡后，用无菌解剖刀，在无菌状态下取出整个肠道，切取所需肠段的内容物（条件允许的话，可在无菌操作台进行）；
2）用无菌手术刀挖取内容物，立即放在冰上进行分装并标记；
3）用灭菌离心管分装，单个样本取样量：0.2-0.5g/管。为保证实验顺利进行，每个样本取多管备份，在采样允许的情况下，尽量多采集样品；
4）分装好后，若当天提取DNA，可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。肠道组织样本采集
1）组织样本用无菌磷酸盐缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出；
2）用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织细菌进行DNA的提取；
3）长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存。生殖道样本采集
1）48h内无性行为，不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为，30天内不能用抗生素和抗真菌类药物；
2）用无菌棉签充分取样，用无菌剪刀剪下棉签头部，放入装有Amies培养基的无菌离心管中，置于冰上带至实验室-80℃保存；
3）样本珍贵，需进行多管备份保存；
4）提取DNA时将棉签解冻，漩涡处理5min以重悬细胞。唾液样本采集
1）收集唾液样品时，用蜡胶刺激口腔分泌唾液，然后用5mL的无菌离心管收集1mL；
2）所有的样品收集完后放于-80°C下保存。
农口常见样本采集方法
普通土壤样本采集
1）根据研究目的确定采样范围，取样器具要事先消毒灭菌处理，开始采样；
2）去除表面浮土，使用乙醇火烧的铲子挖取地下5~20cm的土层；
3）去除可见杂质后，土壤过2mm筛网，每个样品从3个及以上采样点采集并混合而成，每5～10g分为一份；
4）保存于无菌离心管中，置于0℃以下运回实验室，用于抽提DNA；
5）如不能马上提取，置于-80℃保存。根际土壤样本采集
1） 使用的器具要事先消毒灭菌处理，采集20cm深的根际土壤于50mL的无菌管里；
2） 用20目的筛子过筛，去除植物根、动物残骸以及其他杂质后分装到无菌离心管里，每管3~5g，迅速放在液氮里储存；
3） 密封后立即放于-80℃储存备用。水体样本采集
1） 根据研究目的确定采样深度和范围；
2） 采集好的水样需要通过滤膜进行过滤，可以根据水样的浑浊程度选择相应孔径的滤膜；
3） 将滤膜-80℃保存备用。
注：清亮水样：可选择小孔径的滤膜，一般选0.22μm或0.45μm的滤膜，过滤水样体积大于10L；
浑浊水样：过滤前静置分离悬浮颗粒，也可以用大孔径的滤膜预过滤一遍，再用小孔径的滤膜进行过滤。活性污泥及沉积物样本采集
活性污泥：从曝气池中取25mL悬浮的活性污泥样本放入无RNA酶的管中，迅速放入液氮并运送到实验室提取DNA；
地表沉积物：取距地表0-10cm的地表沉积物，每个位点取1-2kg的沉积物装入消毒聚乙烯塑料袋中，立刻置于0℃运到实验室进行DNA提取。植物内生菌样品采集
1）用流水冲洗植物根样本表面并摘到小侧根，粘根土壤粒要进行化学消毒（95%的次氯酸钠2min）；
2）用无菌玻璃珠在无菌水中剧烈摇晃，物理去除细菌；
3）用手术刀片划开根部组织以释放内生菌；
4）用无菌玻璃珠在9%的生理盐水中振荡，在30℃的条件下振荡4h以分离内生菌；
5）用5μm滤膜过滤，15000rpm，4℃离心收集沉淀并置于液氮中保存。
微生物多样性研究非常规样本取样方法
小鼠肺泡灌洗液
肺部感染是一种常见疾病，病原种类多，耐药性强。支气管肺泡灌洗液（ bronchoalveolar lavage fluid，BALF）直接取材于病变部位，获得病原菌的机会多，并能大幅减少口咽部定植微生物群对标本的污染，提高病原菌的分离率。
小鼠肺泡灌洗
一般为颈部和胸部解剖，气管和一侧肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端，生理盐水或PBS反复冲洗，一般为3遍，每遍冲洗次数根据需要决定， 3~5次即可，具体操作参考：
1）操作所需的设备（所有设备均需是无菌的）；
2）小鼠麻醉并固定；
3）颈部去毛并消毒；
4）行颈部正中切口；
5）暴露剥离气管，并在气管近端穿线打活结，活结要比较松；
6）在所打活结的远端，剪开气管的1/2，行气管插管，插入后线打死结；
7）1ml注射器抽取1ml的灭菌生理盐水，通过气管插管注入气管内，注意针头不要插太深，以免损伤肺，反复抽吸三次，将液体抽出，大约能吸出0.7ml左右，放入灭菌离心管内。再抽取1ml生理盐水，重复上面的操作两次，这两次每次能抽出肺泡灌洗液0.9ml左右，也注入离心管，如果回收时遇到很大的阻力即可拔出注射器，收集灌洗液，在灌洗的时候可以轻轻的按摩一下，特别是回抽的时候可以这样做，能够提高回收的效率；
8）收集的灌洗液采用0.22um滤膜过滤后，将滤膜冻存-80℃，或直接提取DNA。
上呼吸道样本制备
上呼吸道感染有70%～80%是由病毒引起的，包括鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。另有20%～30%由细菌引起，细菌感染可直接感染或继发于病毒感染之后，以溶血性链球菌最为常见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌等。
取样材料
无菌棉拭子、含采样液的无菌外旋塑料管。鼻腔取样
尽可能使明亮的光线照进鼻腔，将洁净的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。咽喉取样
明亮的光线从检查者肩膀上方照射进张开的口腔，让患者深呼吸，然后发“啊”音，用压舌板轻轻压舌，再用洁净的咽拭子来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，然后将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。
注意事项：
1）咽喉取样时，拭子不能接触到口腔和舌粘膜。
2）取样时间最好在发病72小时内，晨起后。
3）鼻腔和咽部样品，可只收集一种，也可同时收集2种并混合。
皮肤样本制备
洁净的皮肤拭子（无菌棉签）来回擦拭皮肤表面，将拭子或棉签放入无菌管内，－80℃保存，干冰运输即可。建议多擦拭几个拭子，保证取样量。